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在自然界中，CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分。由于CRISPR–Cas系統(tǒng)的可編程性，以及某些Cas效應(yīng)器在各種細(xì)胞類型和生物體中的魯棒性，使其在生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。

天然存在的CRISPR–Cas系統(tǒng)分為兩大類：第1類，使用多蛋白復(fù)合物用于核酸切割；第2類，使用單蛋白效應(yīng)域進(jìn)行切割。由于單蛋白效應(yīng)域提供的優(yōu)勢，第2類系統(tǒng)是用于生物學(xué)研究和翻譯應(yīng)用的最廣泛的CRISPR工具。第2類進(jìn)一步細(xì)分為II，V和VI三種類型，每種類型都使用不同類型的Cas蛋白。在來自第2類系統(tǒng)的Cas蛋白中，大多數(shù)II型Cas9突變體和V型Cas12突變體具有RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶活性，而VI型Cas13突變體似乎顯示出優(yōu)先的RNA靶向和切割活性。研究團(tuán)隊(duì)主要討論了Cas9和Cas12核酸酶。

Cas9：來自第2類CRISPR系統(tǒng)的Cas9效應(yīng)子是RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，可在目標(biāo)DNA序列中產(chǎn)生DSB。自從化膿性鏈球菌（SpCas9）在體外和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過Cas9核酸酶對DNA進(jìn)行程序化切割的首次報(bào)道以來，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多的Cas9突變體，并對其進(jìn)行了基因組編輯測試，包括來自金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌的同源序列，空腸彎曲菌和許多其他生物。

Cas12：Cas12核酸酶包含V型CRISPR系統(tǒng)的幾種突變體。這些蛋白質(zhì)僅具有單個(gè)RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)兩條鏈的目標(biāo)DNA切割。Cas12a（早期被命名為Cpf1）是最早被發(fā)現(xiàn)并廣泛用于基因組編輯的Cas12核酸酶。

修復(fù)通路：細(xì)胞內(nèi)存在多種DSB修復(fù)機(jī)制，DSB修復(fù)機(jī)制可分為兩大類：對斷裂的DNA末端進(jìn)行重新連接（末端連接），通常在DSB位點(diǎn)附加核苷酸缺失或插入；以及使用DNA模板進(jìn)行同源性定向修復(fù)（HDR）。CRISPR–Cas核酸酶最常用于有效和選擇性地破壞靶基因序列。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，核酸酶誘導(dǎo)的DSB最常通過易出錯(cuò)的末端連接過程進(jìn)行修復(fù)。

Cas突變體的開發(fā)：

• 擴(kuò)大基因組編輯劑的靶向范圍一直是CRISPR–Cas技術(shù)開發(fā)的主要重點(diǎn)。目前大量的工作集中在擴(kuò)大Cas9突變體的靶向范圍，特別是SpCas9，但是識(shí)別富T-PAM序列的Cas12突變體的發(fā)現(xiàn)和工程化將可能繼續(xù)擴(kuò)大Cas效應(yīng)器的靶向性。此外，研究團(tuán)隊(duì)注意到工程化Cas蛋白突變體的活性不如野生型蛋白，當(dāng)Cas蛋白用于更高要求的應(yīng)用，如編輯人類遺傳疾病的動(dòng)物模型或靶向被內(nèi)源性蛋白質(zhì)占據(jù)的DNA位點(diǎn)時(shí)，這種缺陷最為明顯。因此，構(gòu)建能夠在訪問某些具有挑戰(zhàn)性的PAM序列時(shí)保持高活性的穩(wěn)定Cas突變體仍然是未來發(fā)展的一個(gè)重要方向。

• 具有更高DNA特異性的工程化Cas突變體。Cas核酸酶的精確靶向取決于其將靶向序列與整個(gè)基因組中存在的類似脫靶序列區(qū)分開的能力。盡管在識(shí)別和工程設(shè)計(jì)更高保真度的Cas突變體方面已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，這些突變體可以在很大程度上減少脫靶編輯，但是對這些突變體的高通量評估表明，這類突變體的靶位點(diǎn)活性較低。此外，大多數(shù)高保真度的Cas9突變體都不能容忍標(biāo)準(zhǔn)化向?qū)NA的變化，包括5'G的添加或錯(cuò)配。這些因素限制了它們在實(shí)踐中的實(shí)用性。因此，在降低脫靶活性的同時(shí)保持其有效的靶位點(diǎn)編輯活性，并保障系統(tǒng)與各類向?qū)NA突變體的兼容性，是未來優(yōu)化的重要方向。

先導(dǎo)編輯器系統(tǒng)是一種最新的基因組編輯技術(shù)，可以精確、有針對性地引入所有12種可能類型的點(diǎn)突變（即所有6種可能的堿基對轉(zhuǎn)換），小插入和小缺失。主要的編輯器是Cas9切口酶域（滅活的HNH核酸酶）和工程逆轉(zhuǎn)錄酶域之間的融合蛋白。雖然先導(dǎo)編輯器的效果令人驚喜，但仍有許多待解決的問題，例如細(xì)胞狀態(tài)/類型對編輯效率的影響，先導(dǎo)編輯過程中涉及的DNA修復(fù)機(jī)制等。同時(shí)探尋適用于先導(dǎo)編輯的小型逆轉(zhuǎn)錄酶對于其未來應(yīng)用相當(dāng)關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

Anzalone, A.V., Koblan, L.W. & Liu, D.R. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol 38, 824–844 (2020). 

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