發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡 (EV)，包括外泌體和微泡，在各種生物過程和維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。由于具有保護作用，干細胞衍生的 EV 可用于減少受體細胞的氧化應激和細胞凋亡。此外，EV/外泌體已被用作干細胞和實質(zhì)細胞之間的定向通信工具，使它們能夠作為生物標志物。同樣，改變的 EVs/外泌體可以通過裝載蛋白質(zhì)、小干擾 RNA 和病毒載體用于藥物遞送，特別是因為 EVs/外泌體能夠穿過血腦屏障。
人類誘導多能干細胞 (iPSC、iPS細胞) 衍生的 EV 具有獨特的特性，源自不同譜系規(guī)格的 iPSC 的 EV/外泌體以及這些干細胞衍生的外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有重要作用。
細胞外囊泡 (EVs) 是具有跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白的脂質(zhì)包裹囊泡，直徑為 30-1000 nm。外泌體是直徑在 30 到 200 納米之間的 EV 子集。EVs 包含各種類型的核酸以及可溶性和跨膜蛋白，并根據(jù)大小、細胞來源、功能、生物發(fā)生和釋放途徑進行描述。EVs，包括外泌體和微泡，由大多數(shù)細胞分泌，可以被存在于體液（例如血漿）中。從功能上講，EV 在各種生物過程中的細胞間通訊、免疫調(diào)節(jié)、衰老、增殖和分化中發(fā)揮著重要作用，并且對于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。例如，EV 與癌癥、感染、神經(jīng)退行性疾病有關(guān), 和心血管疾病。
EVs/外泌體已被提議作為體內(nèi)遞送的治療性生物制劑（無細胞療法），可促進內(nèi)源性祖細胞增殖、血管生成、細胞外基質(zhì) (ECM) 重塑和調(diào)節(jié)免疫反應。EVs 與細胞比更容易控制，并且可以被賦予更單一的目標。它們具有保護作用，可以通過減少細胞凋亡來促進細胞活力。特別是，誘導多能干細胞 (iPSC) 衍生的 EV/外泌體比 iPSC 衍生細胞更安全，后者可能由于殘留未分化的 iPSC 而在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤。人類 iPSC (hiPSC) 的無限增殖能力，解決了EVs/外泌體標準化和量產(chǎn)問題，特別適用于移植研究，例如缺血性心臟治療。
EVs/外泌體可以針對其貨物進行修改并用于藥物遞送。特別是，EVs 可以裝載生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、 RNA (siRNA) 和病毒載體。例如，EVs 可以在功能上將 siRNAs 和/或 microRNAs (miRNAs) 轉(zhuǎn)移到目標細胞。脂質(zhì)成分增強了它們的穩(wěn)定性，而蛋白質(zhì)含量則減慢了它們的清除速度。EV/外泌體也能夠穿過血腦屏障，然后輸送外源性治療分子（核酸或其他小分子）。一個例子是將多柔比星作為治療乳腺癌的藥物裝載到EVs/外泌體上。
EVs/外泌體還可用于鑒定新的生物標志物，從而在癌癥、神經(jīng)病學和免疫學領(lǐng)域進行早期診斷或可能的藥物治療。例如，EVs 是從體液（如血液）中收集的，并測試其表達用于篩選 GPCR 激動劑或拮抗劑的芯片上的 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)。此外，發(fā)現(xiàn) EV 中的 PCA-3 和 TMPRSS2：ERG 是前列腺癌的 RNA 編碼關(guān)鍵生物標志物。同樣，血液來源的 EV 是用于診斷胎兒發(fā)育并預測胎齡和早產(chǎn)。
幾項臨床試驗正在進行中，使用樹突細胞衍生的外泌體治療不同類型的癌癥或間充質(zhì)干細胞 (MSC) 衍生的外泌體治療移植物抗宿主病。最近發(fā)表了幾篇關(guān)于 MSC 特征的好評-衍生的外泌體。例如，據(jù)報道，MSC-外泌體可增加細胞中的 ATP 并通過磷酸肌醇-3-激酶/AKT 途徑減少氧化應激，從而增強細胞活力。
iPSC 衍生的 EV/外泌體
未分化的 iPSC 衍生的 EV/外泌體
據(jù)報道，未分化的 iPSC 在培養(yǎng)的前 12 小時（平均直徑為 122 nm）釋放約 2200 個 EVs/細胞/小時，在化學成分確定的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的 EVs 比各種類型的 MSCs 多 16 倍。研究還發(fā)現(xiàn) iPSC-EV 中的 mRNA 含有重編程因子 Oct3/4、Nanog、Klf4 和 c-Myc。使用高密度凝集素微陣列分析源自 hiPSC 的 EV 的糖組，同時發(fā)現(xiàn) hiPSC 的特征聚糖特征被捕獲在衍生的 EV 中。由于糖基化是主要的翻譯后修飾，并且聚糖分子附著在膜蛋白和脂質(zhì)上，因此位于 EV 表面的聚糖在 EV 功能中起著重要作用。例如，podocalyxin 是 rBC2LCN（一種 hiPSC 特異性凝集素）的糖蛋白配體。由尿液脫落腎上皮細胞重編程的 hiPSC 分泌的 EV/外泌體也被評估為 RNA 干擾遞送系統(tǒng)。分泌的 EV/外泌體表達 CD63， TSG101 和 ALIX，典型的外泌體標志物。然后通過電穿孔將針對 ICAM-1 的 siRNA 引入 EVs/外泌體。受體細胞表現(xiàn)出選擇性基因沉默和 ICAM-1 表達的抑制。該研究表明 iPSC-EV 可用作天然基因遞送載體，以減少受體細胞的炎癥反應。
iPSC-EV 受重編程細胞來源的影響。例如，比較了來自老化供體細胞 (A-iPSC) 和來自年輕供體細胞 (Y-iPSC) 的 iPSCs 分泌 RNA-外泌體復合物。A-iPSC 分泌的外泌體的 ZSCAN10 表達較差，導致過量的谷胱甘肽介導的活性氧 (ROS) 清除活性（即 ROS/谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)失衡）。ZSCAN10 與 RNA-外泌體復合物的啟動子結(jié)合，可以升高谷胱甘肽過氧化物酶。ZSCAN10 在 A-iPSC 中的表達可以恢復正常的 DNA 損傷反應和細胞凋亡。
此外，觀察到從心臟成纖維細胞重編程的 iPSC 分泌 EV/外泌體，這些 EV/外泌體可以提供心臟保護性 miRNA（例如，miR-21 和 miR-210）并通過 caspase 3/7 抑制保護 H9C2 細胞免受 H2O2 誘導的氧化應激。此外，iPSC 衍生的 EV 發(fā)揮保護作用并影響受體細胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學特征，并增強內(nèi)皮細胞分化。
已在各種動物模型中報道了 iPSC 衍生的 EV/外泌體的治療效果。例如，據(jù)報道 hiPSC 外泌體可以恢復細胞活力和毛細血管樣結(jié)構(gòu)的形成，并減少暴露于高葡萄糖的人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC) 的衰老。
hiPSC-外泌體也被報道可以刺激人真皮成纖維細胞的增殖和遷移。此外，hiPSC-EVs 或外泌體降低了 MMP-1/-3 的表達并恢復了衰老皮膚成纖維細胞中膠原 I 的表達，表明治療皮膚老化的潛力。
iPSC-EVs（約 300 nm）還減少肝星狀細胞活化和肝纖維化，顯示能夠減少促纖維化標志物 α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白 Ia1 和纖連蛋白，以及金屬蛋白酶的組織抑制劑-1.71 miRNA 貨物的基因組學分析iPSC-EVs 顯示出 22 種高度表達的 miRNAs，發(fā)現(xiàn) miR-92a-3p 是最豐富的一種。
特別是，據(jù)報道，iPSC-EVs 可降低衰老 MSCs 的 ROS 水平，改善復制老化 MSCs 的生長，并在遺傳誘導的衰老模型中緩解細胞衰老，部分原因是通過提供細胞內(nèi)過氧化物酶抗氧化酶（例如 PRDX1 和 PRDX2 .62 據(jù)報道，ALIX 過表達（使用 iPSC 的 Crispr/cas9 基因組編輯）可增加 iPSC 衍生的外泌體的治療功能，顯示它們對受損內(nèi)皮細胞的保護能力和拯救 H2O2 阻斷的血管生成。
對 iPSC-EV 和 MSC-EV 進行了直接比較。蛋白質(zhì)組學分析表明，iPSC-EVs 包含參與 EGFR 相互作用和受體酪氨酸激酶信號傳導的蛋白質(zhì)，而 MSC-EVs 包含參與胰島素樣生長因子、Janus 激酶 (JAK) 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 (STAT) 的蛋白質(zhì)，以及Ras 相關(guān)蛋白 1 通路。觀察到三種細胞因子 FGF-2、VEGF 和 IL-4 與 iPSC-EV 的關(guān)聯(lián)顯著高于 MSC-EV。
iPSC 衍生的中胚層細胞分泌的 EV/外泌體
發(fā)現(xiàn)源自 iPSC 分化的中胚層細胞（通常是 MSC 或心肌細胞）的 EV/外泌體通過調(diào)節(jié)細胞凋亡（例如，防止心肌細胞凋亡）、炎癥和纖維化以及促進血管生成在心血管疾病的治療中發(fā)揮保護作用。
這些是通過外泌體貨物（如 miRNA、小分子和蛋白質(zhì)）促進的細胞間通訊實現(xiàn)的。例如，由神經(jīng)鞘磷脂酶 2 和 Rab27 調(diào)節(jié)的 EV/外泌體分泌可以在細胞之間包裝 3' 端尿苷化 miRNA 和穿梭 RNA。
人 iPSC 衍生的 MSC (iMSC) 似乎比成人 MSC 更好地促進細胞存活、增殖和分化，這可能是通過 iMSC 外泌體的分泌。發(fā)現(xiàn)來自 iMSC 的 EV/外泌體促進皮膚細胞增殖并促進傷口。此外，比較了來自 iMSC 和滑膜衍生的 MSC (SMMSC) 的 EV/外泌體治療骨關(guān)節(jié)炎的效果。iMSC 衍生的外泌體顯示出比 SMMSC-外泌體更強的治療效果，因為 iMSC 衍生的外泌體可以促進內(nèi)皮細胞遷移和管形成，以及 ECM 合成（例如，膠原蛋白）。比較了來自 iMSC 和未分化 iPSC-EV 的EV，發(fā)現(xiàn)它們的貨物有很大不同。而 iPSC-EV 包含調(diào)節(jié) RNA 和 miRNA 穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)排序，iMSC-EVs 富含蛋白質(zhì)，組織 ECM 并影響細胞 - 基質(zhì)粘附。
iPSC 衍生的心肌細胞 (iCM) 也會釋放 EV/外泌體，它們的特性仍有待充分表征。在 iCM 外泌體中檢測到熱休克蛋白（例如 HSP20、27、60、70 和 90）。由于缺氧或應激預處理可能會增強外泌體的有益特性，在應激條件下，在 iCM 外泌體中檢測到功能性血管緊張素-1 受體。通過成纖維細胞分泌的富含 miRNA 的外泌體，在心臟成纖維細胞和 iCM 之間發(fā)現(xiàn)了 miRNA 串擾。比較了來自人類胚胎干細胞 (ESC)-CM 和 iCM（用于常氧和缺氧培養(yǎng)）的 EV/外泌體的外泌體 miRNA 和 lncRNA 分析。MiRNA 測序是使用 miRCURY RNA 分離試劑盒進行的，以分離外泌體 RNA。發(fā)現(xiàn)了心臟保護 miR，例如 miR-1、miR-21 和 miR-30，它們與來自 ESC-CM 和 iCM 的外泌體相當。
然而，一些研究表明 iPSC 衍生的心臟祖細胞是比 iCM 更好的來源。通過超速離心分離來自 iPSC 衍生的心血管祖細胞（良好的 EV 產(chǎn)量）和 iCM（未檢測到 EV）的 EV。發(fā)現(xiàn)衍生的 EV 富含參與組織修復的 miRNA。在體外，EVs 被靶細胞內(nèi)化，并觀察到細胞存活、增殖和內(nèi)皮細胞遷移增加。在體內(nèi)，注射 EV 后證明了心臟功能的改善和左心室容積的減少。注射給心肌梗死小鼠的 EVs 表現(xiàn)出促血管生成和細胞保護特性，改善細胞凋亡和肥大。顯然，在體內(nèi)心臟修復方面，富含蛋白質(zhì)和 miRNA 的衍生 EVs 比親代 iPSCs 更安全（無腫瘤形成）。iCM 衍生的 EVs 也顯示出促進血管生成的能力。用 100 μg/mL 處理的內(nèi)皮細胞與無 EV 對照相比，分離的 EV 顯示管形成、傷口閉合和細胞增殖顯著增加。
還研究了 3D 心臟球的 EV/外泌體分離。在小鼠動物模型和基于 hiPSC 的體外人杜氏模型中，球體衍生的 EV 瞬時恢復了杜氏肌營養(yǎng)不良癥的肌營養(yǎng)不良蛋白的部分表達。EV/外泌體治療導致肌營養(yǎng)不良蛋白表達增加、線粒體功能改善、肌細胞增殖增強，以及抑制氧化應激、炎癥和纖維化。類似地，發(fā)現(xiàn)心臟祖細胞衍生的 EV/外泌體通過激活 Akt 和 mTOR 表達來促進 H9C2 細胞生長（即更高的 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷表達）。
EV/外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應用
EVs/外泌體的治療效果
來自神經(jīng)細胞的 EV 在維持神經(jīng)功能方面具有重要作用
在人腦中，少突膠質(zhì)細胞負責神經(jīng)元軸突的髓鞘形成，它們對 N-甲基-D-天冬氨酸受體和 α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸受體上的谷氨酸作出反應。3 EVs少突膠質(zhì)細胞分泌的蛋白質(zhì)含有對髓鞘蛋白和與髓鞘形成相關(guān)的 RNA 特異的蛋白質(zhì)（下圖）。
少突膠質(zhì)細胞衍生的外泌體釋放神經(jīng)遞質(zhì)并為軸突提供神經(jīng)膠質(zhì)介導的營養(yǎng)支持。發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元通訊是由含有 miR-219.86 的外泌體介導的。對于阿爾茨海默病 (AD)，海馬神經(jīng)元衍生的 EV/外泌體可以減少淀粉樣蛋白β (Aβ) 負擔和拯救 AD 小鼠的突觸活動。特別是，EV/外泌體可以捕獲 Aβ 并促進其被小膠質(zhì)細胞清除。小鼠巨噬細胞分泌的外泌體可以增加神經(jīng)細胞的活力并降低 ROS 水平。在神經(jīng)炎癥過程中，小膠質(zhì)細胞可能有類似的機制。90 EVs/外泌體可以被轉(zhuǎn)運到大腦并被小膠質(zhì)細胞吸收，減少激活的數(shù)量炎性小膠質(zhì)細胞和抑制神經(jīng)炎癥。
MSC-EVs 已顯示出對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果
據(jù)報道，MSC-外泌體具有神經(jīng)保護特性，可抑制 6-羥基多巴胺誘導的多巴胺能神經(jīng)元細胞凋亡。MSC-EV 攜帶活性中性溶酶，一種可降解 Aβ 的酶；因此，MSC-EVs 已被證明可以減少 AD 小鼠皮層和海馬的 Aβ 斑塊負荷和營養(yǎng)不良的神經(jīng)突數(shù)量。星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的通訊是由含有 miR-133.35 miR-133 的 MSC-EVs 介導的大鼠腦缺血后下調(diào)，這可以通過含有 miR-133 的 EVs 緩解。miR-133 還介導結(jié)締組織生長因子的下調(diào)并防止膠質(zhì)瘢痕形成。對于中風治療，MSCs 可能通過外泌體介導的 miR-133b 與腦實質(zhì)細胞交流，并導致特定基因的表達，從而促進神經(jīng)突生長和改善功能恢復。據(jù)報道，MSC-EVs 還可以增加髓鞘再生并激活巢蛋白陽性少突膠質(zhì)祖細胞。
iPSC 衍生神經(jīng)細胞的 EV/外泌體用于中風治療
EVs 也來源于人類 iPSC-神經(jīng)干細胞 (iNSCs) 并用于中風治療。iPSC-NSC EVs 被發(fā)現(xiàn)比 iMSC-EVs 小 (<200 nm)。iNSC-EVs 促進巨噬細胞向抗炎表型極化，并在血栓栓塞性中風后增加體內(nèi)調(diào)節(jié)性 T 細胞群。iNSC-EVs 還減少了老年小鼠的病變體積（基于 T2 加權(quán)序列）并改善了行為結(jié)果（例如，平衡木上的協(xié)調(diào)）。這些機制包括抗氧化、促血管生成、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)過程。在缺血性中風的豬模型中，iNSC-EV 治療與對照組相比減少了腦損傷體積并減少了腦腫脹。長期（14 周）評估顯示 EV 治療后胼胝體各向異性分數(shù)值增加。iNSC-EV 中整合素 β1 和 α2b 的存在可能是維持微血管完整性的原因。
EVs/外泌體表現(xiàn)出的神經(jīng)保護作用的主要機制之一
EVs/外泌體表現(xiàn)出的神經(jīng)保護作用的主要機制之一是它們對氧化應激的保護，因此保護神經(jīng)干細胞免受氧化損傷。特別是，EVs/外泌體可能通過兩種可能的機制穿過血腦屏障：（1）被內(nèi)皮細胞內(nèi)化，進行胞吞作用，然后再次釋放以被受體細胞內(nèi)化；（2）通過細胞間質(zhì)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。例如，乳腺癌分泌的外泌體（與 miR-105 相關(guān)）可以下調(diào) ZO-1 表達并增加 BBB 通透性。對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療，iNSC-EVs 可能比iMSC-EV。
用于理解疾病機制和識別潛在生物標志物的 EV 病理生理學
EVs/外泌體的組成取決于細胞類型及其生理狀態(tài)。除了神經(jīng)保護作用外，EVs 已被證明在神經(jīng)變性中具有兩種不同的作用。一方面，EVs 可以調(diào)節(jié)錯誤折疊蛋白（如 Aβ）的吞噬清除。另一方面，EVs可以促進tau、SOD1、TOP-43和朊病毒等有毒蛋白質(zhì)的細胞外釋放。朊病毒疾病源于錯誤折疊的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以從受感染的細胞傳播到健康細胞，從而傳播感染。
最近的研究表明，外泌體可能是 AD 中蛋白質(zhì)聚集體傳播（APP、tau、a-突觸核蛋白和朊病毒）的載體。證據(jù)表明，Aβ 組裝通過與來自 PC12 細胞培養(yǎng)基的外泌體一起孵育而加速。EVs/exosomes 可以介導 APP.102 EVs/exosomes 可以作為淀粉樣斑塊形成的成核中心，并且可以用作疾病狀態(tài)的生物標志物。例如，星形膠質(zhì)細胞釋放的 EV 可能含有突觸蛋白 I；來自小膠質(zhì)細胞的 EV 增加神經(jīng)元的突觸活動；和來自神經(jīng)元的 EV 可以激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能。
例如，小膠質(zhì)細胞衍生的 EV 在 AD 發(fā)展過程中既有有益作用，也有有害作用。它們具有神經(jīng)保護作用（促進 TLR4 依賴性吞噬作用和 Aβ 清除）和神經(jīng)傳遞能力，并提供免疫信號。另一方面，它們促進 Aβ 沉積、神經(jīng)炎癥和突觸功能障礙。miR-155 與炎性小膠質(zhì)細胞相關(guān)，是先天免疫炎癥的主要驅(qū)動因素。在小膠質(zhì)細胞中靶向 miR-155 是神經(jīng)變性的一種可能的治療策略。
特別是，iPSC 衍生的 EV 可以為疾病建模和識別新的生物標志物提供一個有用的平臺。例如，發(fā)現(xiàn) AD-iPSC 神經(jīng)元的分泌組含有細胞外 Aβ 和 tau，這會導致突觸活動功能障礙。來自 hiPSC 衍生神經(jīng)元的 EV 含有比全長 tau 多的中區(qū) tau。在 AD 中, tau 病理學提出聚集的 tau 從神經(jīng)元傳遞到神經(jīng)元。由于 tau 通過 EV 在細胞間移動，外泌體 tau 可用作 AD 的生物標志物。然而，含有聚集 tau 的 EV/外泌體是否能夠在受體細胞中接種單體 tau，仍有待測試。
據(jù)報道，載脂蛋白 E4 基因型導致人腦和 AD 小鼠細胞外空間中外泌體水平降低和 TSG101 表達降低，這可能是由于外泌體生物發(fā)生和內(nèi)體途徑分泌的下調(diào)。在我們的研究中，我們還觀察到 ALIX 和 TSG101 在源自具有早老素 M146V 突變的早發(fā)性 AD 個體的成纖維細胞重編程的 iPSC 系（即 SY-UBH 系）的 EV/外泌體中很少表達，與源自健康 iPSK3 細胞的那些相比。這些結(jié)果表明，與分泌的其他 EV 亞群相比，外泌體產(chǎn)生減少。或者，外泌體生物發(fā)生的另一種可能機制（例如，神經(jīng)酰胺途徑）可能主要被 SY-UBH 細胞利用。
結(jié)論
EV 包含各種類型的核酸以及需要很好表征的可溶性和跨膜蛋白。培養(yǎng)微環(huán)境對 EV 產(chǎn)生有很大影響，例如細胞密度、傳代數(shù)（老化）、缺氧、ECM 和機械應力。衍生的 EV 可以通過大小分布、蛋白質(zhì)組學和 miRNA 分析來表征。已經(jīng)研究了從干細胞（例如，MSCs 和 iPSCs）釋放的 EVs/外泌體的免疫和治療功能。未分化的 iPSC-EVs 可以降低衰老 MSCs 的 ROS 水平并緩解細胞衰老。來自 iPSC-中胚層的 EVs 通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥和血管生成在心血管疾病的治療中發(fā)揮保護作用。來自 iPSC 神經(jīng)祖細胞的 EV 可以被運送到大腦并被小膠質(zhì)細胞吸收，從而減少激活的炎性小膠質(zhì)細胞的數(shù)量并抑制神經(jīng)炎癥。對于神經(jīng)退行性疾病，EVs/外泌體可能會減少 Aβ 負擔并挽救突觸活動。需要對 hiPSC 衍生的 EV/外泌體進行進一步研究，以找到對神經(jīng)系統(tǒng)疾病有益的干預措施。
Richard Jeske, Julie Bejoy, Mark Marzano, and Yan Li，Extracellular Vesicles: Characteristics and Applications，Tissue Engineering Part B: Reviews.Apr 2020.129-144.http://doi.org/10.1089/ten.teb.2019.0252
