摘 要：目的 運用網(wǎng)絡藥理學預測土茯苓抗痛風有效成分的作用靶點及通路。方法 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取土茯苓有效成分及作用靶點，并運用Cytoscape軟件構(gòu)建靶點間相互作用網(wǎng)絡并進行交聯(lián)分析，篩選出土茯苓治療痛風的有效成分及作用靶點，采用MAS 3.0生物分子功能系統(tǒng)獲取通路的相關信息并制成靶點通路網(wǎng)絡模型。結(jié)果 預測得到土茯苓治療痛風的有效成分11個和有效靶點39個，并推斷其作用機制可能與脂肪細胞因子信號通路、ERbB信號通路，Toll樣受體信號通路等有關，且MAPK1、RELA、PTGS2等靶點基因可能起著關鍵性的作用。結(jié)論 基于網(wǎng)絡藥理學探討了土茯苓治療痛風多成分-多靶點-多通路的作用特點，為進一步開展土茯苓治療痛風作用機制研究提供了新的思路和方法。
土茯苓Smilax glabra Roxb. 是治療痛風的傳統(tǒng)中藥，《本草綱目》記載：“惟土茯苓氣平味苦而淡，為陽明本藥，能健脾胃去風濕。脾胃健則營衛(wèi)從，風濕去則筋骨利，故諸證多愈”。現(xiàn)代研究表明，土茯苓含有黃酮、鞣質(zhì)、生物堿等有效成分，可促進血尿酸排出體外，也可緩解尿酸鈉晶體誘導的關節(jié)炎癥反應[1]。然而，土茯苓成分復雜多樣，僅研究其單體物質(zhì)治療痛風的作用只能闡釋其部分藥效物質(zhì)基礎和作用機制，很難闡釋其真正的科學內(nèi)涵。
痛風作為一種尿酸鈉晶體沉積于機體而引起的關節(jié)炎，與嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄減少而形成的高尿酸血癥直接相關。現(xiàn)已證實，促進尿酸排泄是控制血清尿酸水平和痛風風險的關鍵途徑，并進一。此外，有研究證實痛風相關的尿酸鈉晶體是通過產(chǎn)生軟骨降解酶和促炎細胞因子導致關節(jié)破壞[4]，這表明痛風的發(fā)病機制與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應及多個機體調(diào)控位點都有一定的相關性，并非是單路徑調(diào)節(jié)作用。因此，通過多路徑對痛風進行研究顯得尤為重要。
網(wǎng)絡藥理學是基于多向系統(tǒng)藥理學和生物學提出的藥物研究新方法，從多個角度將藥物成分靶點網(wǎng)絡與生物靶點網(wǎng)絡相結(jié)合，更加系統(tǒng)全面地研究藥物的作用機制[5-6]。因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法對土茯苓治療痛風的成分及靶點進行歸納整理，并通過系統(tǒng)生物學分析，深入揭示土茯苓成分-靶點-通路之間的協(xié)同作用，為探索土茯苓治療痛風的機制提供新的思路。
1 方法
1.1 土茯苓成分收集與篩選
以“土茯苓”為關鍵詞在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中查找土茯苓所含成分，通過評價成分的體內(nèi)過程，用口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-like，DL）≥0.18篩選中藥的活性成分[6]。其中OB值是評價藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標，DL值代表成分與已知化學藥的相似性，對確定中藥成分是否對機體產(chǎn)生活性具有重要參考價值[7]。
1.2 相關靶點信息的收集
將收集到的土茯苓有效成分導入到Drugbank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中進行蛋白靶點的匹配，得到成分結(jié)構(gòu)所對應的靶點蛋白，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）查詢其蛋白所對應的基因，進行歸納整理[7]。在TTD數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.org/ttd/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（http:// www.omim.org/）檢索與痛風相關的靶點基因[7]。
1.3 網(wǎng)絡模型的構(gòu)建和分析
將所得到的土茯苓有效成分和Drugbank中得到的靶點進行歸納整理，所得數(shù)據(jù)導入到Cytoscape 3.6.0軟件中進行網(wǎng)絡構(gòu)建，得到土茯苓有效成分靶點網(wǎng)絡。在TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索與痛風相關的基因?qū)氲?/span>Cytoscape 3.6.0軟件并運用Bisogenet插件構(gòu)建疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡。同時，運用Cytoscape 3.6.0中的Merge功能將2個網(wǎng)絡進行合并得到土茯苓可能對痛風起作用的靶點。將所得到的潛在靶點導入MAS 3.0系統(tǒng)（http://mas. capitalbiotech.com/mas3/）進行基因本體（GO）分類富集分析和KEGG通路分析。GO分類富集分析包括分子功能分析、生物學過程分析、細胞組分分析[8]。最后，將分析得到的靶點通路與土茯苓成分相對應，形成有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡。
2 結(jié)果
2.1 土茯苓活性成分的篩選
在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索土茯苓化學成分，共得到74個化學成分，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，同時篩去無對應靶點的成分，最終共獲得14個潛在的有效成分（表1）。
2.2 靶點信息的收集和篩選
2.2.1 成分對應靶點信息的收集和篩選 將收集得到的土茯苓14個潛在有效成分導入到Drugbank數(shù)據(jù)庫中配對得到了274個蛋白，將所對應的靶點蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢其對應的基因。將結(jié)果導入到Cytoscape 3.6.0軟件中進行網(wǎng)絡構(gòu)建，得到土茯苓主要活性成分靶點網(wǎng)絡（圖1）。圖1共有227個節(jié)點、265條邊，紅色箭頭節(jié)點表示土茯苓活性成分，橢圓形節(jié)點表示作用靶點（黃色表示只有1個成分對應此靶點，綠色表示有2個成分作用于此靶點，藍色表示有3個成分可作用于此靶點，粉紅色表示有4個成分可作用于靶點，紫色表示有5個成分可作用于此靶點），越往中心其靶點所對應成分越多。從圖1中可看出經(jīng)篩選后14個土茯苓活性成分均具有多靶點，即相同的靶點可對應于不同的活性成分，不同的靶點可以對應相同的活性成分，體現(xiàn)出土茯苓具有多成分、多靶點的作用特點。
2.2.2 疾病靶點信息的收集和篩選 在TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索與痛風相關的基因，其中在TTD數(shù)據(jù)庫中檢索到16個靶點，在OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到36個靶點，合并篩去重復靶點后共得到50個靶點，將這些靶點導入到Cytoscape 3.6.0軟件，運用Bisogenet插件構(gòu)建疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡。將此網(wǎng)絡與土茯苓主要活性成分靶點網(wǎng)絡運用Cytoscape3.6.0中的Merge功能相映射，取交集部分最終獲得39個土茯苓治療痛風的靶點。將得到的39個靶點制成靶點間相互作用網(wǎng)絡圖，結(jié)果見圖2。從圖2中可看出這39個靶點間有相互作用，表明可能在某種層面上這些靶點是相互聯(lián)系的并通過多途徑、多方面的協(xié)調(diào)起到抗痛風的作用。
2.3 生物功能通路分析
為更進一步探究其作用通路，將所得的39個靶點導入到MAS 3.0系統(tǒng)中進行GO分類富集分析（圖3）和KEGG生物路徑分析（圖4），列出分析結(jié)果排名前15的路徑。其中GO分類富集分析包括分子功能分析、細胞組分分析、生物學過程分析，從圖3中可以看出在分子功能層面上，土茯苓對蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、ATP結(jié)合等影響較大；在細胞組分中，土茯苓對細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜等影響較大；在生物學過程中，土茯苓對藥物反應、泡沫細胞分化的抑制、血壓的調(diào)節(jié)、生物體之間的種間相互作用、脂質(zhì)代謝的負反饋調(diào)節(jié)等影響較大。圖4結(jié)果顯示，土茯苓治療痛風主要涉及的排名前15的通路為脂肪細胞因子信號通路、表皮生長因子受體（ERbB）信號通路、Toll樣受體信號通路、B和T細胞受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。
2.4 土茯苓活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡模型
將富集分析得到的排名前15的通路對應土茯苓治療痛風的靶點及成分，構(gòu)建“成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡模型。此網(wǎng)絡由61個節(jié)點和121條邊構(gòu)成，綠色節(jié)點代表土茯苓中的活性成分，粉紅色節(jié)點代表潛在靶點，黃色箭頭節(jié)點代表調(diào)控通路，邊代表三者之間的相互作用，圖中節(jié)點越大表明其對痛風的影響越大（圖5）。分析結(jié)果表明，MAPK1、核轉(zhuǎn)錄因子65（RELA）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（PTGS2）這3個靶點基因的網(wǎng)絡節(jié)點度排位靠前，為網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點，表明它們可能是土茯苓治療痛風的核心作用靶點。每種活性成分對應多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現(xiàn)了土茯苓多成分、多靶點治療痛風的作用機制。同時多條通路之間是通過共有靶點連接而非獨立分開的，表明各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到治療痛風的作用。
3 討論
0%和DL≥0.18的土茯苓候選成分，經(jīng)痛風疾病靶點對接得到11個活性化學成分。其中，8個化合物有相關文獻報道，分別為β-谷甾醇[9]、谷甾醇[10]、柚皮素[11]、豆甾烯醇[12]、落新婦苷[13]、花旗松素[14]、薯蕷皂苷元[15]、槲皮素[16]。除此之外，存在一些尚未被報道的生物過程及有效成分，這些生物過程和有效成分的功效將成為未來研究土茯苓抗痛風的潛在方向，如4,7-二羥基-5-甲氧基-6-甲基-8-甲酰基黃烷、順式-二氫槲皮素、(?)-花旗松素等，其藥效學及作用機制有待進一步驗證。
痛風的發(fā)病機制與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應及多個機體調(diào)控位點都有一定的相關性。因此，本研究共預測得到MAPK1、RELA、PTGS2等39個土茯苓治療痛風的關鍵靶點。其中，MAPK1作為炎癥常用通路中的一員，其與炎癥的嚴重程度有密切關系，為重要的炎癥評價指標[17]。RELA基因可編碼產(chǎn)生核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65亞基蛋白并參與NF-κB二聚體的形成，而NF-κB幾乎是所有細胞類型中都存在的多效轉(zhuǎn)錄因子，是一系列信號轉(zhuǎn)導事件的終點，許多生物過程如炎癥、免疫、分化、細胞生長、凋亡等都與其具有非常密切的關系，所以常以此靶點作為評價藥物抗痛風作用的指標[18]。而PTGS2則負責炎癥性前列腺素的產(chǎn)生，參與炎癥和有絲分裂的發(fā)生，同時PTGS2與其他預測所得出的靶點都有密切聯(lián)系。因此，這些靶點都在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、脂質(zhì)代謝、細胞凋亡等生物過程中起著至關重要的作用，同樣也是治療痛風的重要靶點。
本研究將所得到的靶點通過GO富集化分析得到與痛風密切相關的通路，如ErbB信號通路、Toll樣受體信號通路、B和T細胞受體信號通路、MAPK信號通路等。這些通路與炎癥以及代謝性障礙密切相關。本研究結(jié)果表明土茯苓治療痛風具有多成分、多靶點、多通路的特點，下一步也將對所預測出來的靶點通路進行科學驗證。
綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法研究土茯苓治療痛風的機制，闡述了多靶點與多成分間復雜網(wǎng)狀相互作用關系，為進一步系統(tǒng)地開展土茯苓治療痛風的實驗研究及臨床應用提供理論依據(jù)。
參考文獻（略）
來 源：郭 璐，夏道宗，駱葉姣，張曉熙，趙鑫鈺. 基于網(wǎng)絡藥理學探討土茯苓治療痛風的作用機制 [J]. 中草藥, 2019, 50(6):1413-1418.
